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食品中氯丙醇酯、縮水甘油酯測定的整體解決方案Ⅰ—— GB 5009.191-2024

更新時間:2024-04-24      點擊次數:830

氯丙醇酯污染是國際上比較關注的食品安全熱點問題之一,近些年,常有報道植物油、嬰幼兒奶粉等食品中檢出氯丙醇酯和縮水甘油酯。氯丙醇酯是氯丙醇類化合物與脂肪酸的酯化產物,食品中檢出量較高的是3-氯丙醇酯,在谷物、咖啡、魚、肉制品、馬鈴薯、堅果和以植物油為原料的熱加工油脂食品中都有3-氯丙醇酯檢出;縮水甘油酯是脂肪酸與縮水甘油的酯化產物,它與氯丙醇酯是一對孿生兄弟,形成機理相似,在油脂精煉過程中,縮水甘油酯通常會伴隨3-氯丙醇酯一起形成,3-氯丙醇酯含量高,縮水甘油酯含量也高。

安譜實驗參照國標《GB 5009.191-2024 食品安全國家標準 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、縮水甘油酯的測定》第二篇第一法,使用快速堿水解方法進行酯鍵斷裂,苯基硼酸進行衍生,氣相色譜-串聯質譜進行檢測,內標法進行定量,對嬰幼兒配方奶粉中的氯丙醇酯和縮水甘油酯的含量進行了檢測,方法操作簡便,回收率高,精密度好。



1、原理

試樣中加入同位素內標,用氫氧化鈉-甲醇溶液進行酯鍵斷裂反應,3 -氯- 1,2-丙二醇酯、2-氯-1,3-丙二醇酯和縮水甘油酯分別轉化為游離態3 -氯- 1,2-丙二醇(3-MCPD)、2-氯-1,3-丙二醇(2-MCPD)、縮水甘油(Gly)和相應的脂肪酸甲酯;以酸性溴化鈉溶液進行中和,生成的縮水甘油轉化為穩定的 3-溴-1,2-丙二醇(3-MBPD);試液經凈化去除脂肪酸甲酯等雜質后,進行苯基硼酸衍生,以氣相色譜-串聯質譜儀檢測,內標法定量。

酯鍵斷裂反應中,生成的游離態3-MCPD在堿性條件下會部分轉化成縮水甘油,經酸性溴化鈉溶液作用生成3-MBPD;同位素13C3-3-MCPD在相同條件下轉化成13C3-3-MBPD的比例和3-MCPD轉化成3-MBPD的比例一致,通過轉換關系對試液中總縮水甘油含量進行修正,得到試樣中縮水甘油酯含量。




2、標準品

實驗用到的標準品信息見下表:

表1 標準品信息

食品中氯丙醇酯、縮水甘油酯測定的整體解決方案Ⅰ—— GB 5009.191-2024

2.1 標準品溶液配置

氯丙醇酯混合標準中間液(10 μg/mL):分別準確移取1 mL 100 μg/mL 3-MCPDE、2-MCPDE標準溶液至10 mL容量瓶中,用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存,保存期 6個月。

氯丙醇酯混合標準工作液CaL I(2 μg/mL):準確移取1 mL 10 μg/mL 氯丙醇酯混標中間液,用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存,保存期 3個月。

氯丙醇酯混合標準工作液CaL II(0.2 μg/mL):準確移取1 mL 2 μg/mL 氯丙醇酯混合標準工作液I,用甲苯定容至10 mL。臨用現配。

縮水甘油酯標準中間液(10 μg/mL):準確移取1 mL 100 μg/mL 縮水甘油酯標準溶液至10 mL容量瓶中,用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存,保存期 6個月。

縮水甘油酯標準工作液CaL I(2 μg/mL):準確移取1 mL 10 μg/mL 縮水甘油酯標準中間液,用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存,保存期 3個月。

縮水甘油酯標準工作液CaL II(0.2 μg/mL):準確移取1 mL 2 μg/mL 縮水甘油酯標準工作液I,用甲苯定容至10 mL。臨用現配。

內標混合標準工作溶液(13C3-3-MCPDE:2µg/mL,D5-2-MCPDE:2µg/mL,D5-GE:2µg/mL):分別準確移取0.4 mL 50 μg/mL 13C3-3-MCPDE、D5-2-MCPDE和D5-GE標準溶液到10 mL容量瓶中,用甲苯稀釋至刻度。于-20 ℃保存,保存期 3個月。


2.2 標準曲線配制

按照下表所示,分別配制氯丙醇酯標準曲線和縮水甘油酯標準曲線。加入甲苯、叔丁基甲醚(tBME)、內標工作溶液和相應的混合標準工作溶液,按照“樣品前處理"進行操作,上機檢測得到標準曲線。

表2 氯丙醇酯標準曲線的配制

食品中氯丙醇酯、縮水甘油酯測定的整體解決方案Ⅰ—— GB 5009.191-2024

表3 縮水甘油酯標準曲線的配制

食品中氯丙醇酯、縮水甘油酯測定的整體解決方案Ⅰ—— GB 5009.191-2024

標準品配制注意事項:

1、氯丙醇酯濃度均以對應的氯丙醇計,縮水甘油酯濃度以縮水甘油計,定量計算中需特別注意。

2、如使用純品型標品,需注意計算標品的純度和對應的折算系數。建議選擇安譜璀世溶液型標品,進行稀釋配制,操作更加方便。

3、為確定反應過程中3-MCPD在轉化成縮水甘油的含量,本方法需要分別配制氯丙醇酯和縮水甘油酯兩組標準曲線,但內標為同位素標記,可以不進行分開配制,將13C3-3-MCPDE、D5-2-MCPDE和D5-GE三者混合使用。




3、前處理步驟

試劑配置:

硫酸水溶液(25%):將25 mL硫酸轉移至含有50 mL純水的100 mL容量瓶中。用純水稀釋至刻度線并混勻。

酸性溴化鈉溶液(溴化鈉600 g/L):將60 g溴化鈉溶解于70 mL純水中。將溴化鈉溶液轉移至含有3.5 mL 25%硫酸溶液的100 mL容量瓶中。用純水稀釋至刻度線并混勻。

氫氧化鈉-甲醇溶液(0.35 mol/L):稱取1.4 g 氫氧化鈉,加入甲醇溶解,轉移至100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,混勻,轉移至塑料瓶中,儲存于10℃下。臨用現配。

苯硼酸溶液:稱取12.0 g苯硼酸,加入100 mL的95%丙酮水溶液,混勻。溶液可在室溫下儲存三個月。

乙_醚-石油醚溶液(1+1):量取乙_醚和石油醚各100 mL,混勻。

1%乙二醇溶液:移取 100 µL乙二醇,加水定容至10 mL,混勻。


試樣提取:

準確稱取嬰幼兒配方奶粉試樣0.5 g(精確至1 mg)于40 mL玻璃螺紋樣品瓶中,準確加入100 µL混合內標工作液(2 µg/mL);加入2 mL 65 ℃±5 ℃水,渦旋混勻,再加入1 mL氨水,蓋塞渦旋混勻,在65℃±5℃水浴下振蕩30 min,取出后冷卻至室溫。加入3 mL乙醇,渦旋后加入5 mL乙_醚,振搖5 min,然后加入5 mL石油醚,繼續振搖5 min。待溶液靜置分層后,取上層溶液于40 mL玻璃樣品瓶中;再加入乙_醚和石油醚各5 mL,重復萃取1次,合并有機相于40℃下氮吹濃縮至干,用2 mL乙_醚-石油醚溶液(1+1)淋洗樣品瓶內壁,將洗液轉移至8 mL玻璃螺紋樣品瓶中,于40 ℃下氮吹至干,供堿水解。


堿水解(酯鍵斷裂反應):

向提取樣品中加入100 µL甲苯、200 µL叔丁基甲醚(tBME)。渦旋混勻30 s,10°C水浴冷卻6 min。

加入預冷的200 µL氫氧化鈉-甲醇溶液(0.35 mol/L),渦旋混勻10 s,繼續10°C水浴7 min進行酯鍵斷裂反應。然后加入600 µL酸化溴化鈉水溶液(溴化鈉600 g/L),渦旋混勻10 s,停止反應。讓溫度穩定在室溫靜置至少5 min,以使所有縮水甘油完_全轉化為3-MBPD。


試樣凈化:

在樣品中加入600 µL異辛烷,渦旋混勻10 s,取出上層有機相,棄去。再加入600 µL異辛烷,渦旋10 s,然后取出上層有機相,棄去,注意不要取到任何水層。


衍生化反應:

向凈化液中加入100 µL苯基硼酸溶液,渦旋30 s后,加入100 µL 1%乙二醇溶液和1.0 mL異辛烷,渦旋,靜置分層,必要時可離心使分層徹_底,取上層溶液至裝有約0.3 g無水硫酸鈉的玻璃樣品瓶中,渦旋混勻10 s,提取液過0.22 μm的疏水性PTFE針式濾器后供氣相色譜-串聯質譜儀進行測定。


前處理注意事項:

1、0.35 mol/L甲醇鈉溶液建議存放在4℃條件下,建議至少存放2h以上,臨用前拿出;

2、10°C低溫酯交換反應時需盡量將整個螺紋瓶浸泡在水中,以保證螺紋瓶內溫度穩定;

3、前處理過程中盡量避免使用塑料耗材,可使用玻璃螺紋瓶、玻璃巴斯德吸管、玻璃移液管、手動進樣針等耗材,建議進行方法空白實驗監控過程本底情況;

4、建議使用疏水性PTFE針式濾器進行過濾;

5、前處理過程中會存在3 -氯- 1, 2-丙二醇酯轉換生成的縮水甘油(Gly)的副反應,在上述條件下,13C3-3 -氯- 1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯(13C3-3-MCPD-PP)轉換為13C3-Gly的轉換率需控制在10%左右,如轉換率過高需排查前處理過程,轉化率偏高的主要原因可能是溫度控制不理想導致;

6、在上述條件下,2-MCPD可轉化為縮水甘油的比率<1%,可以忽略不計。




4、儀器條件

氣相色譜-串聯質譜聯用儀

色譜柱:毛細管氣相色譜柱CD-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm,貨號:GAEQ-554421)

進樣量:2 µL

進樣口溫度:300℃

進樣模式:不分流進樣

載氣:氦氣,純度≥99.999 %

色譜柱流速:1.0 mL/min

程序升溫:70 ℃保持1 min,10 ℃/min升至100 ℃,5 ℃/min升至180 ℃,以25 ℃/min升至320 ℃保持5 min。

傳輸線溫度:320℃

離子源溫度:280℃

離子化能量:70 eV

溶劑延遲時間:8 min

掃描模式:多反應監測模式(MRM模式),離子對信息見下表:

表4 目標物離子對信息

食品中氯丙醇酯、縮水甘油酯測定的整體解決方案Ⅰ—— GB 5009.191-2024

儀器維護注意事項:

1、隨著進樣次數的增加,儀器輕微污染,目標物保留時間可能發生偏移;

2、該實驗對儀器污染比較嚴重,儀器受到嚴重污染后,可能導致目標物響應降低、分離度變差等情況,需注意儀器的清洗維護,包括進樣針的清洗,離子源的清洗,色譜柱的老化等;

3、如儀器配制程序升溫進樣口和反沖功能,可明顯降低對儀器的污染程度。

4、建議色譜柱加裝2m相同固定相的預柱,定期對預柱進行更換,可延長色譜柱的使用壽命。




5、實驗譜圖

食品中氯丙醇酯、縮水甘油酯測定的整體解決方案Ⅰ—— GB 5009.191-2024

圖1 氯丙醇酯和縮水甘油酯標準溶液譜圖

(標線第4點  STD4)

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圖2 奶粉樣品空白和樣品加標的TIC譜圖

(上圖為樣品空白,下圖為樣品加標0.20 mg/kg)




6、實驗數據

6.1 標準曲線數據

以標準工作液中標準品的質量(以醇計)為橫坐標,以標準品與對應內標的峰面積比為縱坐標,繪制3-MCPDE、2-MCPDE 和 GE 的標準曲線,標準曲線見表5。

以氯丙醇酯標準系列衍生液中 3-MCPD 與13C3-3-MCPD 的峰面積比為橫坐標,3-MBPD 與13C3-3-MBPD 的峰面積比為縱坐標,繪制 3-MCPD 轉化為 3-MBPD 的標準曲線,用于計算試液中 3-MCPDE水解產物 3-MCPD 轉化為 3-MBPD 的峰面積,標準曲線見表5。

表5 標準曲線

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6.2 加標回收率數據

本次實驗方法空白未檢出氯丙醇酯和縮水甘油酯,奶粉樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的本底含量分別為0.033、0.019、0.008 mg/kg,其中縮水甘油酯含量的計算已經校正了3 -氯- 1,2-丙二醇酯的轉換影響。

樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的回收率數據見下表。

表6 奶粉基質的加標回收率數據(n=3)

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數據計算注意事項:

1、本實驗3-氯丙醇酯使用13C3-3 -氯- 1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯作為定量內標;2-氯丙醇酯使用D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯作為定量內標;縮水甘油酯使用D5-縮水甘油棕櫚酸酯作為定量內標;

2、縮水甘油酯是通過前處理轉換為 3-溴-1,2-丙二醇(3-MBPD)進行上機檢測;

3、樣品中縮水甘油酯GE的計算需扣除3 -氯- 1, 2-丙二醇酯轉換生成的縮水甘油(Gly)的影響,轉換量(GE 的高估值)需要通過試液中 3-MCPD 轉化而成的 3-MBPD 的峰面積A1進行計算,而A1需要通過3-MCPD 轉換 3-MBPD 的標準曲線進行計算得到。計算中需注意不同計算目的的內標選擇。

4、樣品中氯丙醇酯濃度均以對應的氯丙醇計,縮水甘油酯濃度以縮水甘油計,計算中需特別注意。




7、實驗結論

使用安譜實驗標準品和相關耗材,參照國標《GB 5009.191-2024 食品安全國家標準 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、縮水甘油酯的測定》第二篇第一法,快速堿水解方法,使用同位素內標法進行定量,3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的回收率在90%-110%之間,RSD小于11%。該方法操作簡便,快速,穩定,能夠很好的滿足奶粉基質中氯丙醇酯和縮水甘油酯的檢測。




8、實驗中所用到的耗材

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